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高压细胞破碎仪厂家指导如何提取高质量的RNA

发布时间:2018-12-17   点击次数:259次

   高压细胞破碎仪厂家指导提取高质量的RNA的步骤如下:

1、细胞裂解

   细胞的获取方式不同,采用的裂解方法也不尽相同。

   若是组织中提取,按照每50-100mg样品加入1ml Trizol的比例加入Trizol,而后匀浆破碎样品。细胞破碎后在室温下静置5分钟,这样可以分离出核蛋白复合物(nucleoprotein complexes),然后离心去除细胞碎片。

四川11选5走势图   若是培养瓶中贴壁细胞,则先用冰PBS洗2次,而后按每10平方厘米区域加入1ml Trizol的比例加入Trizol, 吹打混匀处理。

   若是悬浮细胞,离心收集细胞,去除培养基,然后加入适量Trizol吹打混匀处理。

   可以发现这步操作主要用到了Trizol这个试剂。Trizol的主要成分是苯酚,是有效的蛋白变性剂。它能够抑制酶活性包括RNAaes,这样可以保证RNA不会被降解掉,同时Trizol能够使细胞裂解。

2、抽提RNA

   向EP管中的细胞液加入200ul氯仿,涡旋15秒后,室温静置3分钟,然后4℃,12000rpm,15min条件下离心。离心后分3层,上层为无色或淡粉色含有RNA,中层为白色含有DNA,下层为红色含有蛋白质和脂质。我们所需的RNA由于氯仿的作用就分在上层的水相中。

   氯仿是有机溶剂,添加氯仿会使细胞内的蛋白变性沉淀,可以通过离心进行去除。同时加入氯仿后,水相和有机相会分层,将水相中的酚抽提以免损伤核酸,另外还能溶解一些脂溶性杂质纯化RNA。

3、沉淀RNA

   吸取上层水相于新的EP管中,不要吸取中间层或下层的部分,加入等体积的异丙醇,一般是500ul上清和500ul异丙醇,少的时候可以取200ul的上清。两者充分混匀,室温放置10分钟,然后4℃,12000rpm离心10分钟。离心结束后,弃去上清,管底可见白色胶状沉淀,这就是RNA了。

4、洗涤RNA

   为了进行RNA的洗涤,需要用DEPC水配制75%的乙醇溶液,现配现用。DEPC水就是是用DEPC(diethyl pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水,里面不含杂质RNA,DNA和蛋白质。

四川11选5走势图   按照添加的Trizon的量1:1体积配乙醇溶液,一般是750ul分析纯乙醇加上250ul DEPC水,在涡旋仪上使乙醇溶液与RNA充分混匀,4℃,9000rpm,5min离心。然后小心弃去上清,不要吸走管底的RNA哦。

5、再次洗涤RNA

   重复第四步骤,再次洗涤RNA,弃去上清后,控干EP管。室温下将EP管倒置在吸水纸上5-10min,酌情加入20-50ul DEPC水溶解RNA,这就是我们终提取到的RNA了。

6、测定RNA纯度&浓度

   用微量紫外分光光度计取1-2ul RNA检测即可。A260/A280值在1。8-2。0间符合纯度。RNA在260nm处有大吸收,A260=1。0代表RNA的浓度为40ug/ml。A280用于检测蛋白污染,纯RNA样品的A260/A280=2。1,一般所得比值在1。8-2。0间也是普遍认可的。另外,我们也可以测定A230。A230用于检测其他污染,主要来自RNA提取试剂,理想的A230值要大于1。5。另外RNA的完整性可以用1%的琼脂糖凝胶电泳验证。


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